重組酶聚合酶擴(kuò)增（Recombinase polymerase amplification reaction，RPA）
自20世紀(jì)90年代初以來，大量的等溫核酸擴(kuò)增方法涌現(xiàn)，有基于核酸序列的擴(kuò)增（NASBA，又稱轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增，TMA）、信號(hào)介導(dǎo)的核糖核酸擴(kuò)增技術(shù)（SMART）、解旋酶依賴性擴(kuò)增（HDA）、重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA）、滾環(huán)擴(kuò)增（RCA）、多重置換擴(kuò)增（MDA）、環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）和鏈置換擴(kuò)增（SDA）。其中RPA反應(yīng)條件溫和，擴(kuò)增效率高，非常適合臨床快速診斷、食品檢測、疫情防控、工業(yè)應(yīng)用、現(xiàn)場實(shí)時(shí)檢測等應(yīng)用。
1.簡介
與PCR等溫?cái)U(kuò)增方法相比，RPA具有操作簡單、反應(yīng)速度快、對(duì)設(shè)備要求低等優(yōu)點(diǎn)。在靈敏度方面，RPA可以檢測最低水平樣品中的痕量核酸。在一些研究中，RPA甚至可以檢測到PCR無法檢測到的低濃度DNA。在特異性方面，RPA可以從不同物種和標(biāo)本類型的基因組DNA中識(shí)別和擴(kuò)增靶基因。RPA抗干擾能力強(qiáng)，檢測結(jié)果可與PCR高度一致。此外，RPA可以在37-42°C下運(yùn)行，無需復(fù)雜的溫度控制設(shè)備，非常適合資源匱乏環(huán)境下的現(xiàn)場檢測，并可以在20 min內(nèi)得到檢測結(jié)果，有利于樣品的大規(guī)模篩選和快速檢測。
2.反應(yīng)機(jī)理
重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)通過模擬DNA體內(nèi)擴(kuò)增，在等溫條件下產(chǎn)生目的片段。該技術(shù)主要依賴重組酶、單鏈結(jié)合蛋白和鏈置換DNA聚合酶。重組酶能夠不通過加熱就解開雙鏈DNA。重組酶聚合酶擴(kuò)增反應(yīng)開始時(shí)，重組酶在ATP的參與下結(jié)合引物，形成核酸蛋白復(fù)合體，這些復(fù)合體能夠掃描與引物序列互補(bǔ)的目標(biāo)雙鏈DNA。接著，核酸蛋白復(fù)合體侵入5'端位點(diǎn)形成D狀環(huán)。單鏈結(jié)合蛋白與被置換單鏈結(jié)合使其穩(wěn)定。同時(shí)，重組酶離開寡核苷酸的3'端，降解后被DNA聚合酶利用。之后，鏈置換DNA聚合酶結(jié)合在核酸蛋白復(fù)合體的游離3'端，進(jìn)行鏈延伸，形成新的互補(bǔ)鏈。在鏈延伸的過程中，新合成的單鏈與原始互補(bǔ)鏈配對(duì)。以上步驟循環(huán)進(jìn)行，實(shí)現(xiàn)DNA的指數(shù)增長。
Fig. 1 重組酶蛋白與每個(gè)引物形成復(fù)合物（A），掃描DNA的同源序列（B）。然后通過重組酶（C）的鏈置換活性將引物插入同源位點(diǎn)，單鏈結(jié)合蛋白穩(wěn)定了置換的DNA鏈（D）。隨后重組酶分解，引物3'端可進(jìn)入置換DNA聚合酶（E）的鏈，從而延長引物（F），通過循環(huán)重復(fù)該過程實(shí)現(xiàn)了指數(shù)放大。
3.RPA檢測的影響因素
RPA的突出之處源于其特定的反應(yīng)成分和機(jī)理。RPA檢測的細(xì)微差別取決于內(nèi)在因素（如引物、探針和核酸模板的設(shè)計(jì)），并與外在因素有關(guān)（如反應(yīng)溫度和攪拌、對(duì)錯(cuò)配的耐受性、抑制劑和背景DNA）。此外，RPA過程中的核酸標(biāo)記、RPA擴(kuò)增產(chǎn)物的清理和擴(kuò)增后處理也是實(shí)現(xiàn)RPA檢測的重要細(xì)節(jié)。
3.1 RPA模板、引物、探針及其設(shè)計(jì)
RPA試驗(yàn)中DNA模板的GC含量應(yīng)在40%-60%之間，并且應(yīng)避免長同質(zhì)聚合物軌道、少量直接/反向重復(fù)和回文序列；引物GC含量應(yīng)在30%-70%之間，5′端應(yīng)避免鳥嘌呤長跡，推薦胞苷類；引物3′端推薦添加鳥嘌呤和胞苷，以提高性能。此外需要避免引物和探針之間的重疊，減少對(duì)擴(kuò)增效率的影響。
- 模板
RPA最初被證明是一種DNA核酸擴(kuò)增方法，后來發(fā)現(xiàn)通過添加逆轉(zhuǎn)錄酶，RNA 也可以作為模板。無論和核酸模板類型如何，在試驗(yàn)中推薦RPA擴(kuò)增子長度應(yīng)低于500個(gè)核苷酸，大多數(shù)RPA擴(kuò)增子長度在100到250個(gè)核苷酸之間，在此區(qū)間內(nèi)會(huì)產(chǎn)生快速有效的擴(kuò)增。
- 引物
與PCR不同，RPA引物的長度相對(duì)較長（建議至少為30個(gè)核苷酸，但通常在32至35個(gè)核苷酸之間）。較短的PCR引物（通常在18到25個(gè)核苷酸之間）也可以用于RPA反應(yīng)，但可能會(huì)降低反應(yīng)速度和靈敏度。
- 探針
TaqMan等傳統(tǒng)探針不能用于RPA，PCR Taq聚合酶也與擴(kuò)增系統(tǒng)不兼容，對(duì)于實(shí)時(shí)檢測通常使用2種探頭，RPA-exo或fpg。exo探針是一個(gè)長寡核苷酸（46-52個(gè)堿基），帶有內(nèi)部堿基類似物（如四氫呋喃，THF），位于熒光基團(tuán)和淬滅劑之間，具有封閉的3'末端。非堿性殘基用作酸外切酶的底物，只有在探針與靶序列結(jié)合后才能切割THF，熒光產(chǎn)生通常在RPA反應(yīng)期間的5-10分鐘內(nèi)產(chǎn)生可檢測的信號(hào)。與exo探針相比，fpg探針更短（32-35個(gè)堿基），它具有5′淬滅劑和下游5-6個(gè)堿基的熒光團(tuán)，通過C-O-C接頭連接到非堿性核苷酸的核糖上。fpg是一種8-氧鳥嘌呤DNA糖基化酶，它識(shí)別并切割熒光團(tuán)，同時(shí)留下2個(gè)不可延伸的序列，是與核酸外切酶不同的催化模式。
3.2 溫度和攪拌的影響
反應(yīng)溫度和反應(yīng)過程中的攪拌是兩個(gè)重要的外在影響因素。
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溫度
推薦的RPA反應(yīng)溫度在37-42℃之間，但在低至25℃的溫度下，經(jīng)過RPA放大和隨后的側(cè)流條帶檢測，仍然可以產(chǎn)生正信號(hào)。此外，環(huán)境溫度對(duì)RPA反應(yīng)也有影響，當(dāng)環(huán)境溫度低于10℃時(shí)，RPA反應(yīng)不穩(wěn)定，但延長反應(yīng)時(shí)間可以提高陽性結(jié)果的可得性。
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攪拌與震蕩
反應(yīng)溫度為RPA中的酶提供了合適的工作環(huán)境，而攪拌則可以增加均質(zhì)溶液反應(yīng)中RPA組分之間的相互作用。建議對(duì)RPA反應(yīng)執(zhí)行兩次混合步驟，一次在過程開始時(shí)，另一次在反應(yīng)4分鐘后。前者是混合所有RPA試劑來引發(fā)反應(yīng)，后者是為了防止反應(yīng)試劑局部耗盡，從而提高反應(yīng)速率。
此外，在整個(gè)RPA反應(yīng)過程中不斷震蕩混勻，可以進(jìn)一步加快RPA反應(yīng)速度，特別是當(dāng)模板濃度接近檢測極限時(shí)，可獲得更穩(wěn)定的陽性結(jié)果，提高靈敏度。
3.3 對(duì)錯(cuò)配、抑制劑和背景DNA的耐受性
除了溫度和攪拌，對(duì)錯(cuò)配、抑制劑和背景DNA的耐受性也是實(shí)現(xiàn)高效、靈敏RPA反應(yīng)的重要因素。
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錯(cuò)配
RPA具有耐錯(cuò)配能力，引物5′端或中心的錯(cuò)配只會(huì)輕微地影響RPA反應(yīng)，由于聚合酶從3′端延伸引物和探針，所以位于3′端的錯(cuò)配對(duì)反應(yīng)有顯著影響。然而，一般的RPA錯(cuò)配容忍度（在引物3′端之外）可能是有利的，因?yàn)樗槍?duì)高度多態(tài)的靶標(biāo)引物設(shè)計(jì)提供一定的靈活性。在高度多態(tài)的靶標(biāo)中，很難定位長期保守的靶區(qū)，所以這種錯(cuò)配耐受性的缺點(diǎn)是傾向于對(duì)密切相關(guān)的物種進(jìn)行非特異性檢測。
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抑制劑和背景DNA
在測試臨床或現(xiàn)場樣品時(shí)，可能會(huì)在樣品制備和處理時(shí)引入干擾物質(zhì)（如抑制劑），影響核酸擴(kuò)增。研究表明RPA對(duì)一些聚合酶抑制物有耐受性，例如，當(dāng)血紅蛋白（20gL-1）、肝素（0.5U）、尿液（1.25%)時(shí)對(duì)RPA反應(yīng)無影響；但在十二烷基硫酸鈉（0.05%/v/v）和尿液（10%）存在下反應(yīng)被完全抑制，同時(shí)在模板濃度接近檢測極限時(shí)，反應(yīng)更容易受到抑制劑影響。除了對(duì)抑制劑的耐受性外，RPA還能夠在背景DNA存在的情況下擴(kuò)增靶核酸。
4.RPA的應(yīng)用
4.1 細(xì)菌檢測中的應(yīng)用
基于RPA和側(cè)向流試紙條的雙重檢測生物傳感器來檢測霍亂弧菌和創(chuàng)傷弧菌。該生物傳感器具有靈敏度和特異性高、反應(yīng)時(shí)間短、設(shè)備簡單等優(yōu)點(diǎn)，非常適合基層醫(yī)院和現(xiàn)場檢測。此外，用于檢測銅綠假單胞菌和副溶血性弧菌的重組酶聚合酶擴(kuò)增結(jié)合側(cè)向流試紙條（RPA-LFS）也已經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
4.2 在真菌檢測中的應(yīng)用
目前，醫(yī)學(xué)上主要通過形態(tài)和生理表型對(duì)真菌進(jìn)行檢測。此方法檢測時(shí)間長，陽性檢出率低。例如新型隱球菌是一種有條件的病原體，大多數(shù)患者有中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染癥狀，死亡率高。檢測新型隱球菌的常用方法是墨水染色和病原體培養(yǎng)。培養(yǎng)法是檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，但培養(yǎng)時(shí)間長不利于臨床快速診斷。墨跡染色法受試樣類型限制，陽性檢出率低?；谶@種情況建立了用于目視快速檢測新型隱球菌/格特隱球菌的RPA-LFS。
4.3 在病毒檢測中的應(yīng)用
逆轉(zhuǎn)錄重組酶聚合酶擴(kuò)增（RT-RPA）和RPA-LFS方法比RPA-CRISPR更早應(yīng)用，也廣泛用于病毒檢測。RPA-LFS還可以聯(lián)合檢測流行性出血性疾病病毒、血清型病毒和呼吸道合胞病毒。由于一些病毒（如胡椒黃斑病毒）在其復(fù)制周期中具有兩個(gè)階段的DNA和RNA，建立了RPA和RT-RPA來檢測病毒。RPA在病毒檢測中的應(yīng)用往往首先需要逆轉(zhuǎn)錄。如果將逆轉(zhuǎn)錄和RPA擴(kuò)增分為兩個(gè)步驟，則氣溶膠產(chǎn)生和污染的風(fēng)險(xiǎn)增加。
4.4 在寄生蟲檢測中的應(yīng)用
RPA和實(shí)時(shí)熒光的結(jié)合允許實(shí)時(shí)檢測過程，并且比RPA-LFS具有更低的交叉污染風(fēng)險(xiǎn)。RT-RPA還可以針對(duì)不同寄生蟲的特定基因設(shè)計(jì)引物探針，以建立多個(gè)RT-RPA。目前多個(gè)RT-RPA已成功應(yīng)用于同時(shí)快速檢測馬泰勒氏菌和卡巴利巴貝蟲。除了傳統(tǒng)的熒光探針外，熒光染料SYBR Green I與RPA相結(jié)合也常用于檢測寄生蟲，例如諾氏瘧原蟲。RPA已成功應(yīng)用于檢測許多寄生蟲，但應(yīng)用尚未廣泛。目前的研究大多是相對(duì)簡單的RPA-LFS、實(shí)時(shí)熒光RPA等，RPA與其他方法相結(jié)合的進(jìn)一步研究相對(duì)較少。
4.5 在耐藥基因檢測中的應(yīng)用
抗生素的過度使用會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌耐藥，給臨床疾病的診斷和治療帶來巨大挑戰(zhàn)。細(xì)菌耐藥監(jiān)測對(duì)指導(dǎo)臨床用藥、避免或延緩耐藥菌株的產(chǎn)生具有重要意義，RPA的快速、高效、簡單優(yōu)勢在抗性基因檢測中發(fā)揮著重要作用。RPA具有與PCR相當(dāng)?shù)臋z測能力，有時(shí)其靈敏度甚至高于PCR。
4.6 在轉(zhuǎn)基因食品檢測中的應(yīng)用
目前，基于蛋白質(zhì)水平和核酸水平檢測轉(zhuǎn)基因作物的方法主要有兩種。前者受蛋白質(zhì)變性、檢測試劑等原因的限制，無法滿足大規(guī)模轉(zhuǎn)基因作物的檢測。后者的PCR方法具有較高的靈敏度和特異性，但PCR需要復(fù)雜且昂貴的熱循環(huán)儀器，操作流程復(fù)雜，不適合現(xiàn)場檢測。建立快速便捷的檢測方法將大大提高轉(zhuǎn)基因食品的檢測效率。RPA方便高效，非常適合基層單位、倉庫、田間現(xiàn)場轉(zhuǎn)基因檢測。然而，只有少數(shù)公司銷售RPA試劑，這限制了其在轉(zhuǎn)基因食品大規(guī)模篩選中的應(yīng)用。
4.7 在SARS-CoV-2檢測中的應(yīng)用
當(dāng)前檢測SARS-CoV-2的主要方法包括實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）、數(shù)字PCR和各種等溫?cái)U(kuò)增方法。其中，RT-qPCR是應(yīng)用最廣泛的方法，但對(duì)設(shè)備、檢測條件、人員操作要求較高。通過將RPA和LFS檢測系統(tǒng)集成到單個(gè)微流控芯片中，建立了用于快速檢測SARS-CoV-2的微流控集成側(cè)流RPA。封閉的微流控芯片克服了氣溶膠污染，簡便的分析系統(tǒng)降低了設(shè)備成本和人工成本。RPA還可以通過添加熒光染料SYBR Green I實(shí)時(shí)或在終點(diǎn)檢測SARS-CoV-2，不需要打開管子，避免氣溶膠污染，并可用肉眼觀察測試結(jié)果，且成本也低于RPA-LFS和RT-RPA。RPA對(duì)設(shè)備和現(xiàn)場檢測環(huán)境要求較低，非常適合SARS-CoV-2的現(xiàn)場篩查。
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